關鍵詞：染色 脂蛋白 核酸蛋白質(zhì) 染色脂蛋白染色、核酸染色 醋酸纖維 瓊脂糖 聚丙烯酰胺電泳

染色方法詳詢—上海遠慕生物

（以下方法介紹僅參考！注：本公司產(chǎn)品僅用于科研實驗?。?/span>

經(jīng)醋酸纖維、瓊脂(糖)、聚丙烯酰胺電泳分離的各種生物分子需用染色法使其在支持物相應位置上顯示出譜帶，從而檢測其純度、含量及生物活性。蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法，現(xiàn)分別介紹如下：

一、蛋白質(zhì)染色

染色液種類繁多，各種染色液染色原理不同，靈敏度各異。使用時可根據(jù)需要加以選擇。常用的染色液有：

1．氨基hei10B(amino black 10B又稱為amidoschwarz 10B或naphthalene blueblack，2B 200)氨基hei10B分子式為C22H13N6S3Na3，MW=715，λmax=620-630nm，是酸性染料。其磺酸基與蛋白質(zhì)反應構成復合鹽，是zui常用的蛋白質(zhì)染料之一，但對SDS-蛋白質(zhì)染色效果不好。另外，氨基hei10B染不同蛋白質(zhì)時，著色度不等、色調(diào)不一(有藍、黑、棕等)；作同一凝膠柱的掃描時，誤差較大。

2．考馬斯亮藍R250(coomassie brilliant blue R250，簡稱CBBR250或PAGE blue83)

考馬斯亮藍R250的分子式為C14H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560-590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。該染料是通過范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結合，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，但蛋白質(zhì)濃度超過一定范圍時，對高濃度蛋白質(zhì)染色不合乎Beer定律，作定量分析時要注意這點。

3．考馬斯亮藍G250(簡稱CBBＧ250或PAGE blue G90，又名xylene brilliant cyanin G)

考馬斯亮藍G250比CBB R250多二個甲基。MW=854，λmax=590-610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點是在三lv乙酸中不溶而成膠體，能選擇地使蛋白質(zhì)染色而幾乎無本底色，所以常用于重復性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。

4．銀染色法

此法是Switzer.R.C和Merril.CR首先提出的，它較CBB R250靈敏100倍。但染色機制

尚不清楚，可能與攝影過程Ag+的還原相似。其靈敏度很高，牛血清為4×10-5μg/mm2，即清蛋白為8×10-5μg/mm2，cyt C為1.7×10-4μg/mm2，因此也常用于凝膠電泳蛋白質(zhì)染色。

二、脂蛋白染色

1．油紅O（oil red）染色

將凝膠先置于平皿中，用5%乙酸固定20min，用H2O漂洗吹干后，再用油紅O應用液染色18h，在乙醇∶水=5∶3中浸洗5min，zui后用蒸餾水洗去底色。必要時可用氨基黑復染，以證明是脂蛋白區(qū)帶。

2．蘇丹heiB（sudan black B）

將2g蘇丹heiB加60ml吡啶和40ml醋酸酐、混合，放置過夜。再加3000ml蒸餾水，乙酰蘇丹黑即析出。抽濾后再溶于丙酮中，將丙酮蒸發(fā)，剩下粉狀物即乙酰蘇丹黑。將乙酰蘇丹黑溶于無水乙醇中，使呈飽和溶液。用前過濾。按樣品總體積1/10量加入乙酰蘇丹黑飽和液將脂蛋白預染后進行電泳。此染色適用于瓊脂糖電泳及PAGE脂蛋白的預染。

三、核酸的染色

核酸染色法一般可將凝膠先用三lv乙酸、甲酸—乙酸混合液、lv化高汞、乙酸、乙酸鑭等固定，或者將有關染料與上述溶液配在一起，同時固定與染色。有的染色液同時染DNA及RNA，如stains-all、溴乙錠、掊花青-鉻礬法等，也有RNA、DNA各自特殊的染色法。

1．RNA染色法

(1)熒光染料溴乙錠(ethidium bromide簡稱EB)：可用于觀察瓊脂糖電泳中的RNA、DNA帶。EB能插入核酸分子中堿基對之間，導致EB與核酸結合。超螺旋DNA與EB結合能力小于雙鏈開環(huán)DNA，而雙鏈開環(huán)DNA與EB結合能力又小于線性DNA，可在紫外分析燈(253nm)下觀察熒光。如將已染色的凝膠浸泡在1mmol/L MgSO4溶液中1h，可能降低未結合的EB引起的背景熒光，對檢測極少量的DNA有利。EB染料具有下列優(yōu)點：操作簡單，凝膠可用1-0.5μg/ml的EB染色，染色時間取決于凝膠濃度，低于1%瓊脂糖的凝膠、染15min即可。多余的EB不干擾在紫外燈下檢測熒光；染色后不會使核酸斷裂，而其他染料做不到這點，因此可將染料直接加到核酸樣品下，以便隨時用紫外燈追蹤檢查；靈敏度高，對1ng RNA、DNA均可顯色。EB染料是一種強烈的誘變劑，操作時應注意防護，應戴上聚乙烯手套。

(2)焦寧Y(pyronine Y)：此染色料對RNA染色效果好，靈敏度高。TMV-RNA在2.5%PAAG，直徑為0.5cm的凝膠柱中檢出的靈敏度為0.5μg；若選擇更合適的PAAG濃度，檢出靈敏度可提高到0.01μg；脫色后凝膠本底顏色淺而RNA色帶穩(wěn)定，抗光且不易退色。

2．DNA染色法

除了用EB染色外，還有以下幾種方法：

(1)甲基綠(methyl grenn)：一般將0.25%甲基綠溶于0.2mol/L pH4.1的乙酸緩沖液中，用lv仿抽提至無紫色，將含DNA的凝膠浸入，室溫下染色1h即可顯色，此法適用于檢測天然DNA。
(2)二苯胺(diphenylamine):DNA中的α—脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑染色1h，再在沸水浴中加熱10min即可顯示藍色區(qū)帶。此法可區(qū)別DNA和RNA。