實(shí)驗(yàn)材料 昆蟲

試劑、試劑盒 胎牛血清 臺(tái)盼藍(lán) 乙醇

儀器、耗材 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)箱

細(xì)胞計(jì)數(shù)器 攪拌臺(tái) 轉(zhuǎn)子 離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)步驟

1.  將4 ml 含10%胎牛血清的wan全昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基加入一個(gè)25 cm2 培養(yǎng)瓶。取出一支凍存Sf9細(xì)胞的安瓿，迅速置于37℃水浴，用手前后劇烈搖動(dòng)融化之，當(dāng)安瓿的內(nèi)容物幾乎wan全融化時(shí)，將安瓿浸入70%乙醇，消毒外壁。

2.  打碎安瓿頸部，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至25 cm2 培養(yǎng)瓶，用手輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻，于27℃溫育2~3 h 直到細(xì)胞貼壁。

3.  除去舊培養(yǎng)液，換5 ml 含10%胎牛血清的新鮮wan全培養(yǎng)液。繼續(xù)溫育，每3天換液一次，直到細(xì)胞生長匯片。

4.  準(zhǔn)備一個(gè)新的25 cm2 培養(yǎng)瓶，加入4 ml 含10%胎牛血清的wan全培養(yǎng)液

5.  當(dāng)Sf9細(xì)胞已生長匯片時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。加入新鮮的wan全培養(yǎng)液，用移液管輕柔吹打或用手掌輕拍培養(yǎng)瓶，重懸細(xì)胞。

6.  用為培養(yǎng)組織細(xì)胞所設(shè)計(jì)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，在25 cm2 培養(yǎng)瓶中接種1×106~2×106個(gè)細(xì)胞，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布。于27℃溫育，每3天用含10%FBS的wan全培養(yǎng)基換液，直到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長匯片。

7.  棄去匯片的單層培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)液，并重懸細(xì)胞。

8.  用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。以約4×105~5×105細(xì)胞/ml 的密度將細(xì)胞接種于一個(gè)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中。于27℃溫育，以60~80 r/min 的速度恒速攪拌。輕微開啟旁邊的通氣孔，以保證充足的空氣。

9.  每隔2~3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×106~2×106細(xì)胞/ml 時(shí)進(jìn)行傳代， 將適量細(xì)胞移至一個(gè)含有新鮮wan全培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中，使終密度達(dá)到4×105~5×105細(xì)胞/ml。或者，倒出適當(dāng)體枳的細(xì)胞懸液，代之以新鮮培養(yǎng)液。

10.  加入0.1 ml 的0.4%臺(tái)盼藍(lán)于1 ml 對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞中，確定細(xì)胞活力。在低倍顯微鏡下檢査細(xì)胞，計(jì)數(shù)被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞（死細(xì)胞），并計(jì)算總細(xì)胞數(shù)。

11.  將細(xì)胞傳代至1份wan全培養(yǎng)液/10%胎牛血請(qǐng)清和1份無血清培養(yǎng)液混合的液體中。讓細(xì)胞長至匯片（單層培養(yǎng)），或達(dá)到2×106~3×106細(xì)胞/ml 的密度（懸浮培養(yǎng)）。

12.  將細(xì)胞傳代至含胎牛血清wan全培養(yǎng)液與無血清培養(yǎng)液比例為1：4的混合液中，讓細(xì)胞生長。

13.  用wan全培養(yǎng)液與無血清培養(yǎng)液比例為1：8至1：10的混合液，重復(fù)細(xì)胞傳代與細(xì)胞生長的步驟。

14.  用無血清培養(yǎng)液傳代細(xì)胞。

15.  計(jì)數(shù)呈指數(shù)生長的待凍存細(xì)胞，于室溫以1 000g 離心10 min，棄去上清液。

16.  用含10%胎牛血清的wan全培養(yǎng)液以1×107~2×107細(xì)胞/ml 的密度重懸細(xì)胞團(tuán)塊。 加入等體積含10%胎牛血清和20%DMSO的wan全培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于冰浴。吸出 1 ml 細(xì)胞移入帶螺口蓋的凍存管中，于-20℃保存2 h，然后于-70℃過夜。

17.  將凍結(jié)的細(xì)胞移至液氮罐中以便長期保存。