酶切的原理：

DNA酶切一般分為質(zhì)粒直接酶切和PCR產(chǎn)物酶切。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為 4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA段稱粘性未端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。

DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是bu可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。

構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。

在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時(shí)。但要wan全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)材料 ：

λDNA; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液; HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。

實(shí)驗(yàn)試劑：

5×TBE電泳緩沖液：

6×電泳載樣緩沖液：0.%溴粉藍(lán)，40%(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于4℃。

溴化乙錠(EB溶液母液:將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于 室溫即可。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、 DNA酶切反應(yīng)

1) 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào)，用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl，再加入重蒸水使總體積為19μl。

2) 將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。

3) 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7℃水浴保溫2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)wan全。

4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br/>
2、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA段來作為電泳時(shí)的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長(zhǎng)度約50kb的雙鏈DNA分子，其商品溶液濃度為 0.5mg/ml，酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3， 2.0， 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個(gè)片段，長(zhǎng)度 分別為21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。

3、 瓊脂糖凝膠電泳

1) 膠板的制備（參見瓊脂糖凝膠電泳詳細(xì)說明）。

2) 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip 頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

3) 電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。

4) 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25分鐘。

5) 觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。

6) DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點(diǎn)，用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線，即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7) DNA酶切片段大小的測(cè)定：在放大的電泳照片上，用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離，根據(jù)此數(shù)值，在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值，進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小(若用單對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA段的大小)。反之，若已知DNA段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。