一. 目的
學(xué)習(xí)用濃鹽法從酵母中提取RNA
掌握用等電點法沉淀RNA
觀察核酸的顏色反應(yīng)，了解核酸定性與定量測定的原理
熟練掌握普通離心機的使用方法
二. 原理
酵母繁殖快，生長周期短；其細胞質(zhì)中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液與菌體分離比較容易。因此，酵母是提取RNA的好材料。
將RNA從細胞中釋放出來在工業(yè)上主要有三種方法—稀堿法、濃鹽法和自溶法。本實驗采用濃鹽法，即利用高濃度的鹽（10% NaCl）在90～100°C條件下改變了細胞膜通透性，并將核蛋白體解離成RNA和蛋白質(zhì)而使 RNA釋放到鹽溶液中。同時，90～100°C的高溫可破壞磷酸單酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。注意，在30～70°C時這兩種酯酶的作用活躍，提取時應(yīng)避免在此溫度范圍內(nèi)停留時間過長。由于核膜內(nèi)的DNA分子量較大，穿越膜孔較困難，一般不易釋放到菌體外面，所以采用離心技術(shù)，可使RNA 溶液與菌體殘渣以及DNA分離。
根據(jù)核酸在等電點溶解度最小的性質(zhì)，將溶液在低溫下調(diào)pH至2.0～2.5，RNA以白色絮狀沉淀形式從鹽溶液中析出。再次離心，固液分離，便可獲得RNA粗產(chǎn)品。
最后用乙醇洗滌沉淀，溶解和去除脂溶性雜質(zhì)和色素以及鹽分雜質(zhì)。由于RNA不溶于乙醇，所以用乙醇洗滌還可以使RNA沉淀物脫水，變得疏松，便于干燥，提高了RNA產(chǎn)品的純度。
DNA和RNA的鑒別，較常用的方法是利用兩類核酸中不同的戊糖各自具備的不同的顏色反應(yīng)，而得以定性鑒別。其中鑒定DNA的方法稱為二苯胺法，鑒定RNA的方法稱為地衣酚（苔黑酚，3,5-二羥甲苯）法。具體反應(yīng)式如下：
三. 實驗材料及設(shè)備
1. 材料
干酵mu母
2. 儀器
離心機電子天平 沸水浴烘箱 抽濾裝置 冰浴
3. 器材
普通試管： 20mL×4（干燥）
錐 形 瓶： 100mL×1
量 筒： 50mL×1
移 液 管： 1mL×2
燒 杯： 250mL×1 100mL×1 50mL×1
離 心 管： 100mL×1
溫 度 計： 50℃×1
表 面 皿： f9cm
滴 管： 2
洗 耳 球： 2
加 樣 器
pH試紙： pH0.5～5.0
濾 紙： f7cm
洗瓶、試管架、移液管架、試管夾、玻棒：各1
四. 試劑的配制
1. NaCl溶液（C.P.）（10%）
2. HCl溶液（6N）
取500mL濃鹽酸，用水稀釋至1000mL。
3. 乙醇（C.P.）（95%）
4. 苔黑酚試劑（又稱地衣酚試劑）
將200mg苔黑酚溶于 100mL濃鹽酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。
（低溫貯藏一周）
5. 二苯胺試劑
將1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL濃硫酸（比重1.84）。
（臨用時配制，用前可加幾滴乙醛。）
五. 操作步驟
1. 取材
在天平上準確稱取gan酵母3.00g，轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中。
2. 濃鹽浸提
取 27mL 10%NaCl溶液，加入到含干gan酵母的錐形瓶中，攪拌均勻；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分鐘；冷卻。
3. 離心
將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉(zhuǎn)移至100mL離心管中，取10mL H2O洗滌錐形瓶，并入離心管中；平衡后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心 15分鐘；將上清液（即RNA提取液）傾入50mL燒杯中，棄去沉淀（菌體殘渣）。
4. 沉淀RNA
(1) 冷卻：將50mL燒杯置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻；將溫度計插入50mL燒杯中，待溶液冷至10°C以下時，取出溫度計。
(2) 調(diào)pI：緩慢滴加 6NHCl于50mL燒杯中，用玻棒一邊輕輕攪拌溶液，一邊測量pH值，調(diào)節(jié)溶液pH至2.0～2.5范圍，溶液中白色沉淀逐漸增多，到等電點時沉淀量最多；繼續(xù)在冰浴中靜止15分鐘，使沉淀充分。
（注意：①嚴格控制pH；②若攪拌過快核酸難以凝聚沉淀。）
5. 離心
將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中，再次平衡、離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘）；棄去上清液，保留RNA沉淀。
6. 洗滌與抽濾
(1) 洗滌：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中，懸浮沉淀，浸泡5分鐘。
(2) 抽濾：取大小合適的濾紙，先在數(shù)字顯示天平上稱重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇濕潤濾紙，開啟真空泵，使濾紙貼緊漏斗，將沉淀及溶液全部轉(zhuǎn)移至布氏漏斗內(nèi)；再用15mL 95%的乙醇洗滌離心管，淋洗濾渣。
7. 干燥
用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙，轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于80°C烘箱內(nèi)干燥。
8. 稱重
取出樣品，在室溫下冷卻數(shù)分鐘后，將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱重。
9. 顏色反應(yīng)
(1) 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同時加2滴NaOH助溶。
顏色反應(yīng)：取4支潔凈、干燥的試管，按下表所示順序操作
六. 結(jié)果處理
1. 寫出核酸產(chǎn)品的顏色和外形。
2. 計算RNA的粗產(chǎn)品的得率。
3. 由顏色反應(yīng)的結(jié)果，說明產(chǎn)品中含有核酸的情況。
 |
 |
 |
