細(xì)胞凋亡是一種在基因控制下的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，通常表現(xiàn)為核濃縮，起皺，膜發(fā)泡以及 DNA pian段化。WB 是研究細(xì)胞凋亡機(jī)理的基本方法之一，但是 WB 也不是誰(shuí)都能做成功的，因?yàn)橛锌赡苣愕牟骄妥鲥e(cuò)了！用 WB 做細(xì)胞凋亡研究樣品制備是步，樣品制備方法至關(guān)重要否則會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果和結(jié)論。
樣品制備，看你是不是這樣做的：
自配裂解液或者購(gòu)買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
對(duì)對(duì)對(duì)！都是這么做啊，扔了取上清！
且慢，我們?nèi)拥袅?，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase 的活性明顯下降。
? 研究方法
1. 分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細(xì)胞提取總蛋白
2. WB 進(jìn)行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 檢測(cè)
? 主要發(fā)現(xiàn)
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時(shí)會(huì)人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進(jìn)一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。
例二．Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
? 研究方法
1. MCF10A-5E 人ru腺上皮細(xì)胞激活 Fas 死亡受體，無(wú)激活組為對(duì)照
2. 分別用 NP-40（不含 SDS 和脫氧膽酸鹽），RIPA buffer， Laemmil（SB）樣品緩沖液提取蛋白
3. WB 進(jìn)行 Clv-caspase-8 檢測(cè), Hsp90,Tubulin，P38 作為對(duì)照
? 主要發(fā)現(xiàn)
結(jié)果顯示，僅在 Laemmil 緩沖液提取的樣品中檢測(cè)到激活形式的 Caspase-8，而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白樣品中均未檢測(cè)到。證明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，某些特定蛋白會(huì)因刺激方式在可溶性和不可溶性組分之間移動(dòng)。
例三．CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010
? 研究方法
1. MDA-MB231 細(xì)胞，分別用 shCon，shSnail 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基及 GD 培養(yǎng)基 12 小時(shí)
2. 使用 RIPA 提取蛋白，分別將 RIPA 可溶性組分和 RIPA 不可溶性組分進(jìn)行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1，WB 檢測(cè)。
? 主要發(fā)現(xiàn)
某些特定刺激誘導(dǎo)凋亡后，P53，caspase3，caspase9 等會(huì)聚集在 RIPA 不可溶組分中，不可溶性組分中 P53 和 caspase 9 信號(hào)甚至比可溶性組分中更強(qiáng)，表明目標(biāo)蛋白在 RIPA 不可溶組分中顯著丟失。證明 RIPA 并不能提取到真正意義上的總蛋白，丟掉的不可溶組分中還有很多蛋白，甚至是目標(biāo)蛋白。
例四 .SU YEON LEE，et al（2010）.Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010
? 研究方法
1. MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng) 4-9 天后，用 RIPA 分別進(jìn)行蛋白提取，分為 RIPA 可溶性組分和不可溶性組分兩組
2. SDS-PAGE 后，立春紅染色（圖 A），用 WB 分別檢測(cè) p53，CuZnSOD，MnSOD，Tubulin（圖 B）
? 主要發(fā)現(xiàn)
MTS 培養(yǎng)過(guò)程中，RIPA 不可溶性組分中蛋白增加，可溶性組分和不可溶性組分蛋白圖譜有很大差異，胞漿中的 CuZnSOD 和線粒體中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性組分中，而 p53 和 tubulin 則在 RIPA 可溶性和不可溶性組分中都存在。這表明，如果僅使用可溶性組分研究目標(biāo)蛋白的定量，則結(jié)論可能是不準(zhǔn)確或出現(xiàn)偏頗。
看了一圈下來(lái)，細(xì)胞凋亡 WB 沒成功的原因，很可能就是因?yàn)槟阌昧?RIPA！
RIPA 不適合做細(xì)胞凋亡 WB 檢測(cè)的原因
1. RIPA buffer 提取蛋白時(shí)會(huì)人工激活 caspase-3 and caspase-7。
2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白常常會(huì)丟失在被丟棄的不可溶組分中，僅使用可溶性組分研究不嚴(yán)謹(jǐn)。
3. RIPA buffer 提取的蛋白圖譜偏差會(huì)得出錯(cuò)誤或偏差結(jié)論，特別是涉及目標(biāo)蛋白的定量問(wèn)題時(shí)。
