抗體制備是免疫學(xué)研究的基礎(chǔ)。制備一個(gè)合適的抗體將會決定著免疫實(shí)驗(yàn)的成敗?？贵w制備過程涉及到很多個(gè)方面，比如免疫原如何設(shè)計(jì)、免疫過程的優(yōu)化、目的抗體篩選、抗體純化、應(yīng)用鑒定等。接下來我們將會對一些關(guān)鍵的技術(shù)難點(diǎn)進(jìn)行解答。

1. 免疫原是如何設(shè)計(jì)的？有什么原則？
解答：免疫原可以是天然蛋白也可以是重組蛋白，甚至是多肽、DNA，所以免疫原的設(shè)計(jì)主要從兩個(gè)方面考慮：免疫原分子的特點(diǎn)抗體應(yīng)用。結(jié)合免疫原分子的特點(diǎn)，抗體的應(yīng)用可以提供預(yù)計(jì)識別的表位類型，確定使用哪種類型的免疫原和免疫原的序列。

2. DNA免疫的原理和方法是什么？
解答：將含有編碼某種抗原基因序列的質(zhì)粒載體作為免疫原，直接導(dǎo)入動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞對該抗原蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生針對目的蛋白的抗體，再通過雜交瘤融合或基因文庫篩選獲得單克隆抗體，或通過血清，@純化獲得多克隆抗體。
DNA免疫方法，目前主要有3種：肌肉注射加電轉(zhuǎn)、靜脈高壓注射法和基因槍肌肉注射。

3. 對于同一種抗原，人源的噬菌體庫篩出的抗體和人體分離的抗體有什么區(qū)別？
解答：應(yīng)該說各有優(yōu)勢。人源的噬菌體庫篩選出的抗體，在一些情況下，可能會產(chǎn)生一些非天然存在的抗體，重鏈和輕鏈的配比不一定是天然的。從人體B細(xì)胞獲得的抗體，是直接分離和測序篩選的，抗體的重輕鏈處于天然狀態(tài)。當(dāng)然，我們也不能說噬菌題庫篩選的抗體就不好，因?yàn)橐话愀嗟氖窃u價(jià)它的親和力和免疫應(yīng)用，以及后續(xù)的生產(chǎn)表達(dá)及結(jié)構(gòu)等，需要綜合評價(jià)。

4. 噬菌體展示淘洗固相篩選和液相篩選效果有差異嗎？
解答：結(jié)合遠(yuǎn)慕生物多年的抗體篩選經(jīng)驗(yàn)，一般會shou選固相淘選，因?yàn)檫@種方法比較簡單，不需要使用生物素標(biāo)記。如果這種篩選方法沒有篩選到我們感興趣的抗體的話，我們也會過渡到液相篩選的方法。

5. 噬菌體淘洗怎么保證庫的多樣性？篩選上有什么注意的原則？
解答：淘洗過程中很多因素都會影響多樣性的結(jié)果，比如方法的選擇、固相、液相等。其次pH值是淘洗中一個(gè)重要參數(shù)。還有就是淘洗的力度和洗脫的時(shí)間也對多樣性結(jié)果有很重要的影響。需要多個(gè)方面進(jìn)行試驗(yàn)條件的優(yōu)化。

6. 應(yīng)用于IHC的單抗開發(fā)，在抗原設(shè)計(jì)上，有什么側(cè)重點(diǎn)？
解答：因?yàn)镮HC的實(shí)驗(yàn)過程涉及到了對它本身抗原的一個(gè)變性的過程，或者說是天然細(xì)胞里面靶點(diǎn)的變性過程。所以在設(shè)計(jì)的時(shí)候，我們會傾向于設(shè)計(jì)成一個(gè)線性的表位，所以一般來說我們傾向于使用多肽這種免疫原的方式，來進(jìn)行免疫組化抗體的開發(fā)。

7. 噬菌體展示與雜交瘤制備抗體比較，哪種更好？
解答：這個(gè)可能更多是考慮噬菌體展示和雜交瘤的優(yōu)缺點(diǎn)。首先從周期上來說的話，相對來說，噬菌體的方式時(shí)間更短一些，另外從篩選上來說的話，噬菌體展示的方法比較穩(wěn)定，而且比較簡單一些，操作上具有優(yōu)勢。但是雜交瘤的方法，畢竟是從一種類似于細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生抗體的方式，所以在某些方面的話，它產(chǎn)生的抗體更多的是天然的重鏈與輕鏈的配比，這一點(diǎn)，在噬菌體上不能做到。

8. 人源化抗體的制備噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠平臺的優(yōu)勢比較？
解答：噬菌體展示技術(shù)具有周期短、準(zhǔn)確、不受氨基酸位點(diǎn)限制等特點(diǎn)，能夠通過多種淘洗和檢測方式對不同表位進(jìn)行篩選，生產(chǎn)成本相對低廉。不足之處在于受到庫容、表達(dá)偏好性和展示效率的影響，抗體多樣性會存在一定程度的限制，同時(shí)通過表面重塑等方法對提高人源化抗體親和力的成功率并不穩(wěn)定。

轉(zhuǎn)基因小鼠制備的全人源抗體，不僅大大減少了潛在的免疫原性，而且由于抗體是在體內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)歷了正常的裝配和成熟過程，從而保證抗體具有較高的靶親和力。大部分轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的單克隆抗體親合力在0.1-10nM之間，也有些轉(zhuǎn)基因小鼠單抗能達(dá)到皮摩爾級或者次皮摩爾級。但其不足之處在于前期研發(fā)投入的周期長，成本高。而且也由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配，因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化模式，使得這些單抗終不是全人源化模式。

9. 抗體如何進(jìn)行長期保存，并保持效價(jià)的穩(wěn)定？
解答：一般情況下，抗體屬于比較穩(wěn)定的蛋白。所以多數(shù)情況下，廠家會推薦-20℃~-80℃長期保存即可，為了避免反復(fù)凍融盡量分裝后保存。此外，也可以通過加甘油避免反復(fù)凍融。當(dāng)抗體濃度低時(shí)加BSA減少抗體吸附起穩(wěn)定劑的作用。對于一些少數(shù)抗體，需要通過優(yōu)化篩選緩沖液已達(dá)到保持抗體穩(wěn)定的效果，優(yōu)化包括鹽濃度、pH、緩沖體系等。