細(xì)胞數(shù)量確定

1.將細(xì)胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每個(gè)孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾O.D.讀數(shù)。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。

4.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性測(cè)定

1.將種子細(xì)胞以103-104個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。

2.將不同濃度的待測(cè)物質(zhì)加入板中。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如，6,12,24或48小時(shí)）。

4.使用重復(fù)移液器向板的每個(gè)孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾O.D.讀數(shù)。

5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。

6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動(dòng)器上輕輕混合1分鐘，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。

數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細(xì)胞數(shù)量，我們提供其中一種方法。

細(xì)胞存活率（％）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As=實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基，CCK-8和待測(cè)化合物的孔的吸光度）。

Ab=空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac=對(duì)照孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)。

2.使用培養(yǎng)基，等比稀釋細(xì)胞懸液為一個(gè)濃度梯度，通常需要5-7個(gè)濃度梯度，每組幾個(gè)復(fù)孔。然后接種細(xì)胞。（注意每孔的細(xì)胞數(shù)量。如果您將細(xì)胞懸液稀釋在管中，在加入培養(yǎng)板的孔之前，請(qǐng)小心再次混勻細(xì)胞。每孔中細(xì)胞懸液的體積應(yīng)該是一致的。）

3.培養(yǎng)直至細(xì)胞貼壁（通常2-4小時(shí)），然后每100μl培養(yǎng)基加入10μl CCK-8。繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。制作出一條以細(xì)胞數(shù)為X軸坐標(biāo)，O.D.值為Y軸坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

可以基于該曲線確定待測(cè)樣品的細(xì)胞數(shù)。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的先決條件是培養(yǎng)檢測(cè)條件相同。

注意事項(xiàng)

1.確保藥物和CCK8均勻分布在培養(yǎng)基中。

2.細(xì)胞增殖越多,顏色越深;細(xì)胞毒性越強(qiáng)，顏色越淺。

3.對(duì)于貼壁細(xì)胞，每孔至少需要1000個(gè)細(xì)胞（100μl培養(yǎng)基）。對(duì)于白細(xì)胞，由于靈敏度較低，每孔至少需要2500個(gè)細(xì)胞（100μl培養(yǎng)基）。推薦的96孔板每孔最大細(xì)胞數(shù)為25000。如果使用24孔或6孔板進(jìn)行該檢測(cè)，請(qǐng)計(jì)算相應(yīng)的每孔的細(xì)胞數(shù)，并調(diào)整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。

4.因?yàn)镃CK8測(cè)定是基于活細(xì)胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用CCK-8測(cè)定活細(xì)胞數(shù)之間有差異。

5.WST-8可能與還原劑反應(yīng)生成WST-8 formazan。如果使用還原劑(例如一些抗氧化劑)會(huì)干擾檢測(cè)。如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。

6.孵育2小時(shí)后，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。

7.注意不要在孔中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾O.D.值。

8.如果您想對(duì)CCK8溶液進(jìn)行滅菌，請(qǐng)使用0.2μm的膜過(guò)濾溶液。

9.孵育時(shí)間因孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而異。通常，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間（長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)）或大量細(xì)胞（~105細(xì)胞/孔）。

10.如果細(xì)胞懸液中存在高濁度,測(cè)量并減去樣品在600nm或更高波長(zhǎng)的O.D值。

11.CCK8不能用于細(xì)胞染色。

12.培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

13.CCK8的毒性非常低，在CCK8測(cè)定完成后，相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞增殖測(cè)定，例如結(jié)晶紫測(cè)定，中性紅測(cè)定或DNA熒光測(cè)定。（除非細(xì)胞極為稀少，不推薦。）

14.該試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母細(xì)胞。

15.在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。

16.我們建議將細(xì)胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔。

17.如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片,450nm濾光片具有最佳靈敏度。

18.測(cè)量450nm處的吸光度，如果您需要進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，作為參考波長(zhǎng)可以測(cè)定650nm處的吸光度。

19.藥物中金屬離子的存在可能會(huì)影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會(huì)100%抑制。